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永生化红细胞(RBC)前体的单克隆筛选

更新时间:2023-02-01      点击次数:4141
  人造血液尝试始于七十多年前,1900年,奥地利医学家卡尔·兰德斯坦纳发现了ABO血型,让输血救人成为了可能。目前,接受手术、癌症治疗和创伤治疗的患者所需的血液供应依赖于志愿献血者。由于需求量大,研发人造血液以替代人自身血液的想法便产生了。到了20世纪中后期,由于献血和输血造成一些传染病如艾滋病、乙肝、丙肝等的传播和流行,也让人对输血用血产生恐惧,因此人们正在努力开发一种更安全、更容易获得的血液供应来源。
 
  这一挑战通过可能的血液嫁接来解决,利用胚胎细胞、骨髓细胞或诱导干细胞在体外产生血细胞。通过癌基因能够增加细胞增殖和减少细胞死亡的能力,来促进通常难以连续培养的红系祖细胞系的细胞生长,往往在培养中细胞系有强劲的增长,但细胞群表现出多异质表型由于Cytena克隆筛选单细胞打印系统(single-cell printer™,scp™)能够高通量生成单细胞克隆,以识别具有理想红系标记表达的克隆。利用这一工作流程,获得200多个单克隆可用于进一步的表达标记分析。
 
  本研究为了实现分化的去核血细胞的持续供应,开发了从转染到单细胞克隆的工作流程,以选择克隆进一步分化为成熟的红细胞(图1)。首先,将5种不同的癌基因(c-myc, BCL-XL, SV40, geT, Bmi-1, LhX-2)单独或成对地转染到来自CD34+干细胞的红系祖细胞系中。
 

 

图1 红系细胞克隆生成流程
 
  注:转染48小时后,通过向培养物中添加dox激活癌基因表达,从而实现持续培养。使用single-cell printer™进行单细胞克隆的筛选,挑出具有表面标记的特异性单克隆,在通过添加干细胞因子(SCF)和促红细胞生成素(EPO)进一步分化,进一步分化为红系细胞。
 
  转染48小时后,通过添加强力霉素(dox)激活癌基因表达。发现个体癌基因转导不会导致细胞永生化,只有联合转导c-myc和BCL-XL才能使红系前体细胞永生化,细胞可以在培养中保存并增殖一年以上(图2A),除了长期培养的能力外,永生化细胞还表现出早期造血祖细胞的典型标志物,包括CD34very lowCD45+/-CD133+/-CD71+CD44highCD105highCD235avery low。然而,去除dox致癌基因表达失活,使进一步分化成为可能(图2B)。
 

 

注:图2(A)永生化红系祖细胞的增殖率。(B)去除dox降低了三种不同细胞克隆的c-myc和BCL-XL癌基因的mRNA表达(编号8,29和34)。
 
  与传统方法相比,single-cell printer™提供了一种高通量分离单细胞克隆的方法,用于进一步的下游分析和筛选。此技术基于类似喷墨的原理,将细胞样品加入至包含微流体结构的芯片中,芯片的底部有一个喷嘴,自由飞行的小液滴在那里被分配,对喷嘴进行连续成像,以确定产生的液滴中是否含有0、1或多个细胞,如果一个液滴含有一个细胞,它将被分配到目标孔板,如果液滴不包含细胞/多个细胞,液滴将作为废物处理。
 
  红系祖细胞被分配到5个充满半固体培养基的96孔板(兼容384孔板)。连续的五张图像(图3A)作为单克隆源性的保证,并确保只分配了一个细胞。经统计有97.7%的孔(469/480)分配到单个细胞其中超过200个可以形成单克隆,在进一步分析形态和表面标记物中发现表达较理想(CD71、CD45、CD34、CD235a)。从培养物中去除Dox,在7天内进一步分化为产生血红蛋白的细胞(图3B),突出了可能发育为成熟红细胞的潜力。
 

 

注:图3(A)single-cell printer™记录沉积到目标板中的单个细胞来源的克隆性保证,单细胞沉积效率为97.7%。(B)红系祖细胞克隆(29)进行进一步分化,去除dox,加入SCF和EPO。通过染色显示,培养物中存在产生血红蛋白的细胞。
 
  本研究表明,通过转染c-myc和BCL-XL癌基因,典型的非分裂前体RBC前体可以获得永生化。所得到的细胞系是异质的,需要单细胞克隆来筛选理想的细胞特征。与传统方法相比,single-cell printer™在保持细胞活力的同时,实现了高通量、稳健的单细胞克隆开发方法,能够产生超过200个克隆,这些克隆后来被进一步分化并鉴定为具有关键的祖细胞标记物。
 
  参考文献
 
  single-cell printer™ | Generating single-cell clones of immortalized red blood cell (RBC) precursors using single-cell dispensing. Romy Kronstein Widemann1, Stefan Zimmermann2, Torsten Tonn1.
 
  关于Cytena公司
 
  Cytena公司潜心研究单细胞打印机(single-cell printer™)技术多年,不断升级设备功能,以一贯温和的分选原理、更加快速的分选效率、更加简易的操作步骤,助力抗体、细胞治疗、基因治疗、干细胞等研究领域的客户快速搭建单细胞筛选平台。艾贝泰生物科技有限公司作为Cytena的单细胞打印机总代理商,为您提供优质的售前售后服务。
 

 

 

 

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关于艾贝泰
 
  广州市艾贝泰生物科技有限公司立足于生物工艺的优化、放大及生产,除了为国内客户提供高品质的Applikon生物反应器,还引进了国外先*的产品,如Nova生化分析仪、Cytena克隆筛选单细胞打印机系统、Kaiser拉曼在线生物工艺分析仪、Flownamics在线取样器、Constant Systems高压细胞破碎仪等。为满足生物制药行业高速发展的需要,艾贝泰也专业研发和生产一次性使用的生物工艺设备和耗材。艾贝泰不断完善生物制药领域的产品线,为用户提供多方位的专业产品解决方案。